免疫組化問題解答

一.染色過強 原因 解決方法 

1.抗體濃度過高或孵育時間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜 

2.孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度 c DAB顯色時間過長或濃度過高 顯色時間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準。

二.非特異性背景染色 原因 解決方法 

1.操作過程中沖洗不充分 每步沖洗3次每次5分鐘 

2.組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長 

3.組織中含內原性生物素 正常非免疫動物血清再封閉

4.血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間。

三.染色弱 原因 解決方法 

1.抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度、孵育時間不能少 于60分鐘 

2.試劑超過有效使用時間 應更換試劑 

3.操作中添加試劑時緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液 使試劑稀釋 （應防止切片干燥） 4.室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜 e 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘。

四.染色陰性 原因 解決方法 

1.操作步驟錯誤 應重試 設陽性對照 

2.組織中無抗原 設陽性對照以驗證試驗結果

3.一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無誤