酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種廣泛應(yīng)用的生物分析技術(shù)，用于定量或定性檢測樣品中的特定蛋白質(zhì)、抗體或其他分子。針對γ干擾素（IFN-γ）這一重要的細胞因子，其專用的γ干擾素ELISA檢測試劑盒通過高度特異且靈敏的方法實現(xiàn)精準測量。以下是該實驗的具體原理及步驟解析：

　　γ干擾素ELISA檢測試劑盒核心機制：抗原-抗體特異性結(jié)合與信號放大

　　1. 固相載體包被捕獲抗體

　　微孔板的每個孔內(nèi)預(yù)先涂布了抗人/小鼠/大鼠等物種來源的IFN-γ單克隆抗體（簡稱“捕獲抗體”）。這些抗體能夠特異性識別并結(jié)合樣本中的IFN-γ分子，形成穩(wěn)定的固相復(fù)合物。未結(jié)合的成分會在后續(xù)洗滌步驟中被去除，從而分離目標蛋白與其他雜質(zhì)。

　　2. 封閉多余位點減少非特異性吸附

　　為防止非目標物質(zhì)黏附于塑料表面導(dǎo)致假陽性結(jié)果，需加入牛血清白蛋白（BSA）或其他惰性蛋白溶液進行封閉處理。此舉可有效阻斷無關(guān)成分與板壁的結(jié)合，提高檢測特異性。

　　3. 標準品與待測樣的平行競爭反應(yīng)

　　將已知濃度梯度的標準品和稀釋后的待測樣本分別加入到已包被抗體的反應(yīng)孔中。此時，溶液中的游離IFN-γ會與固定化的捕獲抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成“夾心”結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)層。此階段的溫度控制至關(guān)重要，通常在室溫下孵育以保證最佳結(jié)合效率。

　　4. γ干擾素ELISA檢測試劑盒檢測抗體標記物引入二次識別

　　隨后添加另一種針對IFN-γ不同表位的酶標多克隆抗體（即“檢測抗體”），它能同時連接已固定的抗原和支持下一步顯色反應(yīng)。常用的標記酶包括辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP），它們能催化底物產(chǎn)生可觀測的顏色變化。

　　5. 底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生可視化信號

　　當所有未結(jié)合的物質(zhì)再次被洗去后，向體系中加入相應(yīng)的酶促反應(yīng)底物。例如，若使用HRP作為標記酶，則選用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）；若是AP，則采用對硝基苯酚磷酸酯（pNPP）。在酶的作用下，無色的底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物，其強度與原始樣本中的IFN-γ含量成正比。

　　6. 終止液定格終態(tài)便于比色讀數(shù)

　　為停止酶促反應(yīng)并穩(wěn)定顯色效果，最后加入硫酸等強酸溶液作為終止劑。此時各孔呈現(xiàn)穩(wěn)定的顏色深度，可通過酶標儀在特定波長下測定吸光度值（OD值），進而繪制標準曲線并計算未知樣本的濃度。