BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                           微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。

測(cè)定原理：

堿性條件下，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽鍵，能將Cu²⁺還原成Cu⁺；2分子的BCA與Cu⁺結(jié)合，生成紫色絡(luò)合物，在540-595nm有吸收峰，562nm處吸收峰Z強(qiáng)。

自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑A：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑B：液體0.5mL×1支，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體2mL×1支，4℃保存。

工作液配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.2mL），將試劑A和B按照50：1的比例混合，蓋緊后充分混勻。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：

1.        液體樣品：澄清液體樣品可以直接測(cè)定。

2.        組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）

冰浴勻漿，10000rpm，4℃離心10min，取上清，即待測(cè)液。

3. 細(xì)菌、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到562 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 工作液置于60℃水浴預(yù)熱30 min。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做一次。

計(jì)算公式：

Cpr (mg/mL)= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）

           =0.5×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）

Cpr (mg/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷ W

           =0.5×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷ W

W: 樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒，適用于測(cè)定蛋白濃度在20-5000μg/ml樣品。測(cè)定前取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，若A測(cè)定管－A空白管﹥1.5，需將樣本用提取液稀釋后再測(cè)定，以確保測(cè)定的準(zhǔn)確性。