胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書

胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書

                                         微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：                          

胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，是一種重要的消化酶。此外，胰蛋白酶還廣泛應用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等的輔助治療。

測定原理：

胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵，釋放出的游離羧基與反應體系中的氫氧化鈉發生中和反應，導致溶液的pH值降低，以苯酚紅為指示劑，測定溶液在555nm處吸收值的變化，可以快速測得胰蛋白酶活性數據。胰蛋白酶在一定范圍內與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關系。

自備儀器和用品：

酶標儀、96孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體120 mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體5 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體5 mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體2 mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）冰浴勻漿，10000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測定步驟：

1. 酶標儀預熱30 min，調節波長到555 nm。

2. 工作液的配制：臨用前根據用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：蒸餾水（V）：試劑三（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合。（注意：現用現配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個空瓶）

3. 吸取5μL樣本，加入195 μL工作液，混勻后立即測定，記錄555nm下1min時的吸光值A1和2min時的吸光值A2。計算△A=A1-A2

注意：如果△A小于0.005，可將反應時間延長到5min。如果△A大于0.5，體系迅速變色，可將樣本用提取液稀釋后測定（建議稀釋10倍），計算公式中乘以相應稀釋倍數。

胰蛋白酶活性計算公式：

使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：室溫下每毫克蛋白質每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個酶活單位。

胰蛋白酶（U/mg prot）= △A ×V反總 ÷（Cpr×V1）÷0.5÷T

=80×△A ÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義：室溫每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個酶活單位。

胰蛋白酶（U/g 鮮重）= △A×V反總÷（W×V1÷V2）÷0.5÷T

=80×△A ÷W

Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；W：組織質量（g）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），5 μL=0.005 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1 mL；V反總：反應總體積，0.2 mL；T：反應時間（min），1 min。