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NAD激酶(NAD kinase, NADK)試劑盒說明書

發布時間:2023/4/25點擊次數:514

NAD激酶(NAD kinase, NADK)試劑盒說明書

                               微量法100/48

 

    正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

NADKEC 2.7.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中是目前所發現的生物體內惟一能夠催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)ATP或無機多聚磷酸[poly(P)]作為磷酰基供體進行磷酸化反應,生成NADP(H)。因此,NAD激酶在合成NADP(H)以及調節NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。

 

測定原理:

NADK催化NAD+磷酸化,生成NADP+NADP+可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH340 nm下測定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100 mL×1瓶,4保存

試劑一:液體10 mL×1瓶,4保存;

試劑二:液體25 mL×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,-20 保存;

試劑四:粉劑×1瓶,-20保存;

 

樣本測定的準備:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、將試劑一和試劑二37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴15min以上。

3、工作液的配制:在試劑三中加入5mL試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

   工作液的配制:在試劑四中加入18mL試劑二,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

4、加樣表

試劑名稱(μL)

測定孔

對照管

樣本

20

20

工作液

80


試劑一


80

充分混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴15min,立即煮沸

2min(蓋緊,防止水分散失)冰浴冷卻,10000g25℃離心10min,取上清

上清液

40

40

工作液

160

160

加完試劑混勻,室溫靜置15min340nm下測定吸光值,ΔA=A測定-A對照。

 

NADK活性計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)NADK活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘生成1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=53.59×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADK活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.107×ΔA

V反總:反應體系總體積,1×10-4 LεNADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,15 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

b.  

c. 96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)NADK活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘生成1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=107.18×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADK活力的計算:

 

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=107.18×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADKnmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.214×ΔA

V反總:反應體系總體積,1×10-4 LεNADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,15 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

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