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酰基轉移酶(alcohol acyl transferase,AAT)活性測定試劑盒說明書

發布時間:2023/5/7點擊次數:492

酰基轉移酶(alcohol acyl transferaseAAT)活性測定試劑盒說明書

                                                    微量法100/96

 

 

   正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

AAT是一個多功能蛋白大家族,主要負責催化生物體內各種酰基化和去酰基化反應,在基因表達、代謝和信號傳導中具有重要作用。

 

測定原理:

AAT催化乙酰CoA轉移乙酰基到丁醇,釋放的CoA還原DTNB生成TNBTNB412nm有吸收峰,測定412 nm吸光度增加速率可計算AAT活性。

 

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20保存。

試劑三:粉劑×1支,4避光保存。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g:提取液體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        液體:直接檢測。

 

AAT測定操作:

1分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到412 nm,蒸餾水調零。

2、工作液的配制:臨用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一,充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

3、試劑三的配制:臨用前加無水乙醇1mL充分溶解待用,用不完的試劑4℃保存。

4 空白管:Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液,充分混勻,35反應15min,加入10μL試劑三,充分混勻,25靜置10min,測定412nm處吸光值,記為A空白管。

5 測定管:Ep管或96孔板中加入10μL樣本180μL工作液,充分混勻,35℃反應15min,加入10μL試劑三,充分混勻,25℃靜置10min,測定412nm處吸光值,記為A測定管。△A=A測定管- A空白管,空白管只要做一管。

 

AAT活性計算:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按照蛋白濃度計算

活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = A ÷×d×V反總÷V×Cpr÷T = 98.04×A÷Cpr

2)按照樣本質量計算

活性單位定義:每克組織每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = A ÷×d×V反總÷(W×V÷V樣總) ÷T = 98.04×A÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:每104個細胞每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = A ÷×d×V反總÷(細胞數量×V÷V樣總) ÷T= 98.04×細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:每毫升樣品每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/mL) = A ÷×d×V反總÷V÷T = 98.04×A

TNB消光系數,13600L/mol/cmd:比色皿光徑:1cmV反總:反應總體積,0.2mLV樣:加入反應體系中上清液體積,0.01mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:蛋白含量,mg/mLW:樣本質量,gT:反應時間,15 min

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按照蛋白濃度計算

活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = A ÷×d×V反總÷V×Cpr÷T =196.08×A÷Cpr

2)按照樣本質量計算

活性單位定義:每克組織每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = A ÷×d×V反總÷(W×V÷V樣總) ÷T = 196.08×A÷W

 

3)按細胞數量計算

活性單位定義:每104個細胞每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = A ÷×d×V反總÷(細胞數量×V÷V樣總) ÷T=196.08×細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:每毫升樣品每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/mL) = A ÷×d×V反總÷V÷T = 196.08×A

TNB消光系數,13600L/mol/cmd96孔板光徑:0.5cmV反總:反應總體積,0.2mLV樣:加入反應體系中上清液體積,0.01mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:蛋白含量,mg/mLW:樣本質量,gT:反應時間,15min

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