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脂肪酸合成酶(FAS)活性試劑盒說明書

發布時間:2023/5/10點擊次數:466

脂肪酸合成酶(FAS)活性試劑盒說明書

                                                         微量法100T/96S



   正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

FAS是脂肪酸合成關鍵酶,催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達于各種組織細胞中,在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達豐富。

 

測定原理:

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoANADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+NADPH340nm有吸收峰,而NADP+沒有;通過測定340nm 光吸收下降速率,計算FAS活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。

試劑二:粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入440μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑四:液體20mL×1, 4℃保存。

試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入840μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。12000g4離心40min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后12000g4,離心40min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

FAS測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到340 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑四置于40℃水浴中預熱30 min

3. 96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五,混勻后于340nm處測定吸光值,記錄第30s90s時吸光值,分別記錄為A1A2△A=A1-A2

 

FAS活性計算:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

 

1)按照蛋白濃度計算

活性單位定義:37中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol/min/mg prot) =(A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V)÷T

=1608×A÷Cpr

2)按照樣本質量計算

活性單位定義:37中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V÷V樣總)÷T

=1608×A ÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:37中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

=1608×A ÷細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:37中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V÷T

=1608×A

εNADPH摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cmd:比色皿光徑,1 cmV反總:反應體系總體積,200μL=2×10-4LCpr:上清液蛋白質濃度,mg/mLW 樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間,1min

 

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

1)按照蛋白濃度計算

活性單位定義:37中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol/min/mg prot) =(A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V)÷T

=3216×A÷Cpr

2)按照樣本質量計算

活性單位定義:37中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V÷V樣總)÷T

=3216×A÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:37中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

=3216×細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:37中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 1個酶活單位

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109 )÷V÷T

=3216×A

εNADPH摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5 cmV反總:反應體系總體積,200μL=2×10-4LCpr:上清液蛋白質濃度,mg/mLW 樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間,1min

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