丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                               微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測(cè)定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來(lái)進(jìn)一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD⁺沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定340 nm光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算PDC活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體18mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1支，﹣20℃保存。

試劑五：液體30μL×1瓶，﹣20℃保存。

混合試劑：臨用前配制，將試劑四和試劑五轉(zhuǎn)移至試劑三中充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六：液體2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，工作3s，間歇10s，工作35次），16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

PDC測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。

4. 測(cè)定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

PDC活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(Cpr×V樣) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷V樣÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4 L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(Cpr×V樣) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷V樣÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4

L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min。