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肉毒堿棕櫚酰轉移酶(CPT-1)試劑盒說明書

發布時間:2023/5/12點擊次數:1162

肉毒堿棕櫚酰轉移酶(CPT-1)試劑盒說明書

                                         微量法100/96


   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

肉毒堿棕櫚酰轉移酶是存在于線粒體內膜的一類酰基轉移酶。可逆地催化從酰基輔酶A將酰基轉移至L-肉毒堿的反應,在轉運脂肪酸通過線粒體內膜的過程中起重要作用。                         

 

測定原理:

基于肉堿和脂酰輔酶A在丙二酰輔酶A存在與否的條件下,通過肉堿脂酰轉移酶(CPT-I)的作用,產生脂酰肉堿,并釋放出巰基輔酶A(COA-SH),與Ellman試劑DN-TB反應后,產生黃色的TNB。通過其吸收峰值得變化(412nm),來定量分析CPT-1的活性。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三:液體1.5mL×1支,-20保存;

試劑四:液體30mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1瓶,4保存;

試劑六:粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

        稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

        將勻漿液于600g4離心5min

        棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4離心10min

        上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CPT-1(此步可選做)。

        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體CPT-1測定。

 

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至412nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

1)在試劑五中加入1mL無水乙醇,混勻,再加入22mL試劑四,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

 

2)在試劑六中加入1mL蒸餾水,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六,混勻,記錄412nm20秒時的初始吸光度A1220秒時的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1

 

CPT-1活性計算:

a.        使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CPT-1nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CPT-1nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T=177.8×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CPT-1nmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.3556×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.4×10-4 LεTNB摩爾消光系數,1.36×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

 

b.       使用96孔板測定的計算公式如下:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CPT-1nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CPT-1nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W ×V÷V樣總)÷T=355.6×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CPT-1nmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.711×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.4×10-4 LεTNB摩爾消光系數,1.36×104 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

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