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中性轉化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒說明書

發布時間:2023/5/22點擊次數:475

中性轉化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒說明書

                                         微量法100/48



   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

蔗糖轉化酶(InvertaseIvr)催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適 pH,將高等植物Ivr分為酸性轉化酶(AI)和中性轉化酶(NI)兩種類型。                          

NI主要存在于細胞質中,負責分解細胞質中蔗糖為果糖和葡萄糖。

 

測定原理:

NI催化蔗糖分解產生還原糖,進一步與3,5-二硝基水楊酸反應,生成棕紅色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范圍內510nm光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算NI活性

 

自備用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用;用不完的試劑4保存;

試劑三:液體15mL×1瓶,4保存;

 

粗酶液提取:

按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。12000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟和加樣表:

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至510nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL

測定管

對照管

樣本

50

50

試劑一


200

試劑二

200


混勻, 37準確水浴30min后,95水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)

試劑三    

125

125

 

混勻,95水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中, 510nm處記錄各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘以相應稀釋倍數),ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設一個對照管。

 

NI活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001x為標準品濃度(μg/mL),y為吸光值。

1)按蛋白濃度計算:

單位的定義:37mg蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

NI活性(μg/min /mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2)按鮮重計算:

單位的定義:37g組織每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

NI活性(μg/min /g 鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1:加入反應體系中樣本體積,0.05mLV2:加入提取液體積,1mLT:反應時間,30min Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g

 

b.96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001x為標準品濃度(μg/mL),y為吸光值。

1)按蛋白濃度計算:

單位的定義:37mg蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

NI活性(μg/min /mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2)按鮮重計算:

單位的定義:37g組織每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

NI活性(μg/min /g 鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1:加入反應體系中樣本體積,0.05mLV2:加入提取液體積,1mLT:反應時間,30min Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g

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