蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷鍵，催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相應(yīng)的葡萄糖基低聚糖。此外，SP還能催化氫醌合成熊果苷，具有很強(qiáng)的美白效果，在化妝品工業(yè)中具有重要應(yīng)用。

測(cè)定原理：

SP能夠以磷酸為受體，催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP⁺生成NADPH，導(dǎo)致340nm光吸收值增加。測(cè)定340nm吸光度增加速率，即可計(jì)算SP活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1支，-20℃避光保存，臨用前加2.5mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1支，-20℃避光保存，臨用前加5mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表：

1.酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm。

2.操作表

SP活性計(jì)算公式：

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

SP活性（nmol/min/mg prot）=×V反總÷V樣÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr

2.        按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8時(shí)，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

SP活性（nmol/min/g 鮮重）=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1608×△A÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8時(shí)，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

SP活性（nmol/min/10⁴ cell）=×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）)÷T=1608×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

：NADPH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min

注意事項(xiàng)：

1.        可選用BCA法測(cè)定蛋白含量試劑盒測(cè)定蛋白含量。

2.        樣本較多時(shí)，可以按照每個(gè)樣本試劑一：試劑二：試劑三=120：20：40（μL）的比例配制工作液，用多少配多少，臨用前立刻配制，10分鐘內(nèi)使用。