錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）試劑盒說明書

微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

錳過氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，主要存在于擔子菌中，屬于木質素降解酶系，能有效的降解木質素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物、DTT，多環芳烴等。

測定原理：

錳過氧化物酶在Mn2+存在的條件下，將愈創木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在465nm有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1支，4℃保存。

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體2mL×1支，4℃保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

2.        細胞：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        培養液或其它液體：直接檢測。

測定操作：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至465nm，蒸餾水調零。

2、  測定前將試劑一、二、三、四在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min以上。

3、  樣本測定表

在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄465nm下30s時的吸光值A1和2min30s后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min以上，測定時加入20µL樣本和180µL混合液測定。

酶活計算公式：

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 413×ΔA÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每104個細胞每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 413×ΔA÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升培養液每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 413×ΔA

ε：愈創木酚摩爾消光系數：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，2×10-4 L；V樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min

b.       用96孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 826×ΔA÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每104個細胞每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 826×ΔA÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升培養液每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 826×ΔA

ε：愈創木酚摩爾消光系數：12100L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，2×10-4 L；V樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min