磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)試劑盒說(shuō)明書

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中，催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：液體16.5uL×1支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支， -20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑四的配制：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、將工作液和試劑四置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。

5、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使ΔA小于0.1可提高檢測(cè)

靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

PEPCK活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）PEPCK活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=3215×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）PEPCK活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=12.86×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。