尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP）試劑盒說(shuō)明書

                                                       微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

UDPG焦磷酸化酶是生物體糖原合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖（UDPG）。

測(cè)定原理：

UGP可逆催化反應(yīng)生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了UGP活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板

試劑組成和配制： 

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體2mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3.        液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1.        紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，20μL試劑四，20μL試劑五，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值A1和330s的吸光值A2，△A=A2-A1

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=643.08×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=643.08×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g