還原型抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）含量測(cè)定試劑盒說明書

微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

AsA又稱維生素C。AsA是輔酶、自由基清除劑、電子共體/受體和草酸鹽與酒石酸鹽生物合成的底物等。作為植物細(xì)胞中最重要的抗氧化劑，AsA在保護(hù)葉綠體免于氧化損傷起著舉足輕重的作用，也是衡量農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

測(cè)定原理：

 在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍(lán)鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼–2–羥基丁酰內(nèi)酯衍生物，在最大吸收波長(zhǎng)420處測(cè)定吸光度。

自備儀器和用品：

研缽、冰、低 溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×2瓶（棕色），4℃避光保存。臨用前配制，每瓶加入7 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑4℃下可保存3天。

樣品中AsA提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；8000g，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3.  血清等液體：直接測(cè)定。

AsA測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到420 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.在EP管中加入下列試劑

混勻，25℃靜置20min，吸取200µL加入微量石英比色皿/96孔板中，420nm下測(cè)定各管吸光值。ΔA=A測(cè)定-A空白。

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

AsA含量計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0088x - 0.018 ，R2 = 0.9978

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AsA (μg/mg prot) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V樣÷（Cpr×V樣）

=113.63×(ΔA+0.018)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AsA(μg/g 鮮重) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V樣÷(W×V樣÷V樣總)

=113.63×(ΔA+0.018)÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

AsA(μg/10⁴ cell) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V樣÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)

=113.63×(ΔA+0.018)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

AsA (μg/mL) =(ΔA+0.018)÷0.0088

=113.63×(ΔA+0.018)

V樣：加入樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1.0 mL; Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0044x - 0.018 ，R2 = 0.9978

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AsA (μg/mg prot) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V樣÷（Cpr×V樣）

=227.27×(ΔA+0.018)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AsA(μg/g 鮮重) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V樣÷(W×V樣÷V樣總)

=227.27×(ΔA+0.018)÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

AsA(μg/10⁴ cell) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V樣÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)

=227.27×(ΔA+0.018)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

AsA (μg/mL) =(ΔA+0.018)÷0.0044

=227.27×(ΔA+0.018)

V樣：加入樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1.0 mL; Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項(xiàng)：

試劑三現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好的4℃保存，3天內(nèi)使用完。