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L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶(Gal LDH)活性測定試劑盒說明書

發布時間:2023/10/30點擊次數:435

L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶(Gal LDH)活性測定試劑盒說明書

                                                微量法 100T/96S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內膜,負責催化植物體內AsA生物合成的最后一步,也是該途徑的關鍵酶之一,對植物體內AsA含量的積累起著至關重要的作用。

 

測定原理:

Gal LDH催化L-半乳糖內酯還原細胞色素C(Cyt c),還原型Cyt c550nm有吸收峰;測定還原型Cyt c增加速率,來計算Gal LDH活性。

自備儀器和用品:

臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入16mL蒸餾水,充分溶解。

試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解。

 

粗酶液提取:

照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。13000g4離心10min,取上清置冰上待測。

 

Gal LDH測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到550nm,蒸餾水調零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min

3.依次在、微量玻璃比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL預熱的試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后于550nm比色,記錄10s130s的吸光值A1A2A = A2A1

 

Gal LDH活性計算公式:

使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

Gal LDH活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1nmol Cyt c 1個酶活單位

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = A÷ε÷d×V反總×109÷Cpr×V樣)÷T

=578×A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

Gal LDH活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘還原1nmol Cyt c 1個酶活單位

Gal LDH (nmol/min/g 鮮重) = A÷ε÷d×V反總×109÷W×V÷V樣總÷T

=578×A ÷W

 

ε:還原型Cyt c摩爾消光系數,17.3×103L/ mol/cmd96孔板光徑(cm)0.5cmV反總:反應體系總體積,0.2mL=0.0002 L1091mol=1×109nmolV樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質含量BCA試劑盒;T:反應時間,2min

 

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后3天內使用完。

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