查爾酮異構酶(Chalcone isomerase, CHI)試劑盒說明書

查爾酮異構酶(Chalcone isomerase, CHI)試劑盒說明書

                                          微量法 100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                     

測定意義：

查爾酮異構酶(Chalcone isomerase, CHI)是第一個被認識的黃酮類化合物合成相關酶，也是黃酮代謝途徑中的關鍵酶之一。查爾酮異構酶和查爾酮合酶一起構成了黃酮類化合物生物合成的限速酶。

測定原理：

查爾酮異構酶（CHI）催化查爾酮環化形成 4,5,7-三羥基黃烷酮，通過測定381nm下的吸光度變化表示CHI的活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；用時加入20mL試劑一充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至381nm，蒸餾水調零。

2、  樣本測定表

在微量石英比色皿或96孔板中加入10µL上清液和190µL試劑二，立即混勻并記錄381nm下初始吸光值A1和37℃保溫30min后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

CHI活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時A381變化0.1為一個酶活力單位。

CHI（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.1÷T =400×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應體系中每小時A381變化0.1為一個酶活力單位。

CHI（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.1÷T =400×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

用96孔板測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時A381變化0.05為一個酶活力單位。

CHI（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.05÷T =800×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應體系中每小時A381變化0.05為一個酶活力單位。

CHI（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.05÷T =800×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。