蔗糖磷酸化酶(SP)測(cè)試盒說(shuō)明書

微量法100T/96S

 測(cè)定意義：

SP(EC2.4.1.7) 要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷鍵，催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到果糖 木糖 半乳糖和鼠李糖等，合成相應(yīng)的葡萄糖基 聚糖 外，SP 還能催化氫/醌合成熊果苷，具有ji強(qiáng)的美白效果，在化妝品工業(yè)中具有重要應(yīng)用

測(cè)定原理：

SP 能夠以磷酸體，催化蔗糖產(chǎn)生 1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸 酶催化6-磷酸葡萄糖，在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用還原 NADP+生成 NADPH，導(dǎo)340nm光吸收值增測(cè)定 340nm 吸光度增 速率，即可算SP活性                                

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：                                                               

天平溫離心機(jī)  恒溫水浴鍋  紫外分光光度  /酶標(biāo)儀  微  石英比色皿/96 孔板和蒸餾水                                                                                                

試劑組成和配制：                                                                        

提  液  液體 100mL×1 瓶，4℃保存                                                    

緩沖液  液體 10mL×1 瓶，4℃保存                                                      

試劑一  液體 5mL×1 瓶，4℃保存                                               

試劑二  液體 1.5mL×1 支，4℃保存                                                     

試劑         液體 1mL×1 支，4℃保存                                               

試劑四     粉劑 1 支，-20℃避光保存，臨用前 1mL 蒸水溶解                           

試劑五     粉劑 1 支，-20℃避光保存，臨用前 1mL 蒸水溶解                           

試劑         粉劑 1 支，-20℃避光保存，臨用前 2mL 蒸水溶解                           

試劑七  粉劑 1 支，-20℃避光保存，臨用前 2mL 蒸水溶解                           

粗酶液提取：                                                                                  

1.      組按照組質(zhì)g提液體  (mL)  15~10 的比例 建議約0.1g組，入1mL提液 進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，清測(cè)

2.      菌真菌按照胞數(shù)104 個(gè)提液體mL500~10001 的比例建議500萬(wàn)胞入1mL提液 ，冰浴超聲波破碎胞率300w，超聲 3         ，間隔7，總時(shí)間 3min然后10000g，4℃，離心 10min，清置于冰測(cè)       

測(cè)定操作表：

1分光光度 /酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 340nm 2、操作表

SP 活性計(jì)算公式：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式

1.    按照蛋白濃度  算

酶活定義  37℃，pH6.8 時(shí)，  毫克蛋白質(zhì)  分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH                      一個(gè)酶活單

ε × d

2.  按照樣本質(zhì)             算

酶活定義  37℃，pH6.8 時(shí)，

克樣本  分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH               一個(gè)酶活單

ε × d

3.    按照  胞數(shù)算

酶活定義  37℃，pH6.8 時(shí)，            10⁴ 個(gè)  胞  分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH               一個(gè)酶活單

ε × d

A÷  胞數(shù)            萬(wàn)個(gè)

ε       NADPH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm  d  比色皿光  ，1cm  V

體  ，2mL V 樣             應(yīng)體系中樣本體     ，0.2mL     W 樣本質(zhì)  ，g Cpr

總         應(yīng)體系總

蛋白濃度，mg/mL

T               應(yīng)時(shí)間，2min

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式

1.    按照蛋白濃度  算

酶活定義  37℃，pH6.8 時(shí)，  毫克蛋白質(zhì)  分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH                      一個(gè)酶活單

ε × d

3.  按照樣本質(zhì)             算

酶活定義  37℃，pH6.8 時(shí)，

克樣本  分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH               一個(gè)酶活單

ε × d

3.    按照  胞數(shù)算

酶活定義  37℃，pH6.8 時(shí)，            10⁴ 個(gè)  胞  分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH               一個(gè)酶活單

ε × d

△A÷  胞數(shù)            萬(wàn)個(gè)

ε      NADPH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm  d  比色皿光  ，0.5cm  V                       總         應(yīng)體系總

體  ，2mL V 樣             應(yīng)體系中樣本體     ，0.2mL     W 樣本質(zhì)  ，g Cpr 蛋白濃度，mg/mL

T               應(yīng)時(shí)間，2min

注意事項(xiàng)：

1.        粉劑-20℃保存，配制好的試劑 3 天內(nèi)使用完

2.        可選用 BCA 法測(cè)定蛋白含  試劑盒測(cè)定蛋白含

蔗糖磷酸化酶(SP)測(cè)試盒僅供科研！