紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測定試劑盒說明書

紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測定試劑盒說明書

                                                      微量法 100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質代謝中，尤其是藥物和毒物的代謝，具有重要作用。ERND在P450酶系中相當于CYP2B亞型，與藥物代謝的去甲基化密切相關。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產物而具有解毒作用，也可使某些藥物經CYP2B代謝活化。

測定原理：

ERND催化紅霉素釋放甲醛，通過Nash比色測定甲醛含量，即可計算出ERND活性。

自備儀器和用品：

普通離心機，超速離心機、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水和冰。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加1mL蒸餾水，充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加0.5mL蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水4.5mL充分溶解。

試劑六：液體×1瓶，4℃保存。

試劑七：液體×1瓶，4℃保存。

標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管，加入10μl標準液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到412 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30 min。

3. 對照管：取0.5mL EP管，加入10μL粗酶液，170μL試劑二，10μL試劑三，10μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入100μL上清液，100μL試劑七，混勻后60℃

水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。

4. 測定管：取0.5mL EP管，加入10μL粗酶液，170μL試劑二，10μL試劑三，10μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新EP管，加入100μL上清液，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。

5. 標準管：取0.5mL EP管，加入100μL標準品，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標準管。

注意：每個樣品都需要做對照管。

ERND活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質量計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（W×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W

C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：100μL=1×10^-4 L；稀釋倍數：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W：樣品質量，g；V樣：加入粗酶液體積，10μL=0.01mL；T：催化反應時間（min），30min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質量計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（W×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W

C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：100μL=1×10^-4 L；稀釋倍數：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W：樣品質量，g；V樣：加入粗酶液體積，10μL=0.01mL； T：催化反應時間（min），30min。