細(xì)胞色素b5（Cytochrome b5）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                         微量法 100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細(xì)胞色素P450和細(xì)胞色素b5是P450酶系的兩個(gè)血紅素蛋白，其比值的變化與P450代謝活性密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

氧化型細(xì)胞色素b5經(jīng)連二亞硫酸鈉還原后，在424nm處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定424nm和490nm處吸光值的差異，即可計(jì)算出細(xì)胞色素b5的含量。

自備儀器和用品：

普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×2瓶，4℃保存。臨用前各加100mL蒸餾水，充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。

工作液配制：臨用前配制，戴一次性手套，小心打開(kāi)試劑三瓶蓋，加試劑二20mL充分溶解，4℃避光可保存1周。

樣品中細(xì)胞色素b5提取：

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、待測(cè)液：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即待測(cè)液，該待測(cè)液需當(dāng)天測(cè)定。

細(xì)胞色素b5含量測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min。

2. 工作液置于25℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入10 μL蒸餾水，200μL工作液，室溫靜置2 min，424nm和490nm處吸光值，424nm處吸光值記為A空白管1，490nm處吸光值記為A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2

4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，加入10 μL待測(cè)液，200μL工作液，室溫靜置2 min，424nm和490nm處吸光值，424nm處吸光值記為A測(cè)定管1，490nm處吸光值記為A測(cè)定管2。

△A測(cè)定管= A測(cè)定管1- A測(cè)定管2。

注意：只需要做一個(gè)空白管。

樣品細(xì)胞色素b5含量計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

細(xì)胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）

                            = 122.8×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

細(xì)胞色素b5含量（nmol/g 鮮重）= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總×（V樣總÷V樣）÷W

                            = 61.4×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素b5納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm； V反總：反應(yīng)體系總體積，210 μL =2.1×10^-4 L；Cpr：待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積，10 μL=0.01 mL；V樣總：待測(cè)液總體積，0.5 mL；W：樣品質(zhì)量（g）。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

細(xì)胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）

                            = 245.6×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

細(xì)胞色素b5含量（nmol/g 鮮重）= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總×（V樣總÷V樣）÷W

                        = 122.8×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素b5納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5cm； V反總：反應(yīng)體系總體積，210 μL =2.1×10^-4 L；Cpr：待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積，10 μL=0.01 mL；V樣總：待測(cè)液總體積，0.5 mL；W：樣品質(zhì)量（g）。