結合態淀粉合成酶（GBSS）試劑盒說明書

結合態淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）試劑盒說明書

                                      微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應，主要負責直鏈淀粉的合成。

測定原理：

GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，同時生成ADP；進一步通過反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP⁺還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應生成的ADP數量呈正比，通過340nm下測定NADPH的增加量，可以計算GBSS活性。

需自備的的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×2瓶，4℃保存；

試劑一：40mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入14mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入8mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑五：液體×1支，-20℃保存；臨用前加入500μL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入500μL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

粗酶液制備 ：

稱取0.1~0.2g組織（建議稱取約0.1g組織），加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、在EP管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫20 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫30 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 4℃離心10min，取上清液（如果一次性測定樣本較多，可以將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即340 nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

GBSS活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數

 =529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GBSS活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數=529×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數：1.9；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數

  =1059×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GBSS活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數 =1059×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數：1.9；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。