淀粉脫分支酶（DBE）試劑盒說(shuō)明書(shū)

淀粉脫分支酶（Starch debranching enzyme，DBE）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                        微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

DBE能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀庵ф湹矸鄣摩?/span>-1，6糖苷鍵，產(chǎn)生線性的葡萄糖鏈，在調(diào)整支鏈淀粉分子的鏈長(zhǎng)方面有重要的作用。

測(cè)定原理：

采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生的還原糖，通過(guò)測(cè)定還原糖含量的變化來(lái)計(jì)算DBE活性。

需自備的的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入6mL試劑一，充分混勻后備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體12mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體35mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

混勻，37℃準(zhǔn)確保溫2h

混勻，95℃水浴5min，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取各管吸光值。ΔA=A測(cè)定

-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。

注意：可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。

DBE活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 3.8458x - 0.165；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 1.9229x - 0.165；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.1mg/mL-1mg/mL。

ΔA線性范圍為0.01-1。