肝酯酶（Hepatic lipase，HL）試劑盒說明書

肝酯酶（Hepatic lipase，HL）試劑盒說明書

微量法100T/48S

注       意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

肝酯酶是脂肪分解酶，在肝實質細胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內皮細胞表面和竇周間隙腔面的肝細胞微絨毛表面，可促進脂蛋白中的膽固醇向類固醇激素轉化，血漿中的HL活性增高時，血漿中小顆粒可導致LDL水平升高，加速動脈粥樣硬化的發生。

測定原理：

肝酯酶水解α-乙酸萘酯產生α-萘酚，可與固藍B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，顏色深淺在一定范圍內與肝酯酶活性成正相關。

自備實驗用品及儀器：

天平、冷凍離心機、研缽、水浴鍋、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制 ：

試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體8mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

1.        組織：按照質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清待測。

2.        細胞：按照細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10000g離心10min，取上清待測。

3.        血清：直接測定。

測定操作：

計算公式：

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y= 0.1519 x -0.1241，R²=0.9994

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 6.58×（△A+0.1241）÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（μmol /min/g 鮮重）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 6.58×（△A+0.1241）÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

                                      = 6.58×（△A+0.1241）÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。HL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷V樣÷T

                                = 6.58×（△A+0.1241）

V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min

b．用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y= 0.076 x -0.1241，R²=0.9994

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 13.16×（△A+0.1241）÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（μmol /min/g 鮮重）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 13.16×（△A+0.1241）÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

                                      = 13.16×（△A+0.1241）÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol α-萘酚為一個酶活力單位。HL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.1241）÷0.076×V反總÷V樣÷T

                                = 13.16×（△A+0.1241）

V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min