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游離脂肪酸(FFA)含量試劑盒(測血清、動物組織、微生物、細胞)

發(fā)布時間:2023/5/17點擊次數(shù):578

游離脂肪酸(FFA)含量試劑盒(測血清、動物組織、微生物、細胞)

                                              微量法100/96

 

 

    意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

游離脂肪酸,也稱為非酯化脂肪酸,在與白蛋白結合的血漿中循環(huán)。動物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項重要的生理生化指標。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關,游離脂肪酸的濃度會因為糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進等疾病而上升。

 

測定原理:

用有機溶劑萃取FFA。含有FFA的有機液與三乙醇胺銅反應,在有機相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFACu。Cu離子與顯色液反應形成紫紅色絡合物。反應形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關系符合朗伯一比爾定律,因此可利用此反應進行比色。

 

自備的儀器和用品:

酶標儀、離心機、可調(diào)式移液器、96孔板、蒸餾水。

試劑的組成和配制:

萃取液:液體 120 mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體 15 mL×1瓶,4保存;

試劑二:液體 15 mL×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,室溫保存;

試劑四:液體 12 mL×1瓶,4保存;

 

樣本前處理:

1.動物組織:按照動物組織質(zhì)量(g):萃取液mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL萃取液),進行冰浴勻漿。震蕩提取15min,5000 rpm 4℃離心5min,取有機相待測。

2.血清:吸取50 μL血清樣本,加入1 mL萃取液,震蕩提取15 min后,4℃,5000 rpm離心5 min,取有機相待測。

3.微生物、細胞:按照細胞數(shù)量(104個):萃取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1 mL萃取液)加入萃取液,冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲2秒,間隔3秒,總時間3min);震蕩提取15 min,然后5000 rpm 4℃離心5min,取有機相待測。

注意:有機相待測液可能存在于上層,也可能存在于下層,注意觀察,體積較多的那一層即為有機相待測液。

 

測定步驟:

1、   酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550 nm。

2、   工作液的配制:臨用前根據(jù)用量按照試劑一(V):試劑二(V):試劑三(m=1mL):1mL):0.66g)的比例充分混勻。(注意:現(xiàn)用現(xiàn)配,用多少配多少,在空瓶中配制,試劑盒中帶有4個空瓶,先將試劑一與試劑二混合,最后再加入試劑三粉劑)

 

3測定管:吸取600μL樣本,加入200μL工作液,蓋緊后震蕩20 min,4℃,5000 rpm離心5 min,分層后取200μL上層有機相,加入100μL試劑四,搖勻,10 min后測定550 nm的吸光值,記為A測定。

4、空白管:吸取600μL萃取液,加入200μL工作液,蓋緊后震蕩20 min4℃,5000 rpm離心5 min,分層后取200μL上層有機相,加入100μL試劑四,搖勻,10 min后測定550 nm的吸光值,記為A空白。

空白管只需測一次。A=A測定-A空白

注意:1、有機溶劑易揮發(fā),加入96孔板后應盡快檢測。

2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機相待測液。

 

FFA含量計算:

標準曲線:y = 0.0161x - 0.0141     R2 = 0.9985   x:棕櫚酸標準品濃度(nmol/mL

                                            y:吸光值差值A

1、血清FFA含量計算:

FFA含量(μmol/mL)=(A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

                 =1.242×(A+0.0141)

2、動物組織、微生物、細胞中FFA含量計算:

1)按樣本蛋白濃度計算

FFA含量(μmol/g鮮重)=(A+0.0141)÷0.0161×V1÷W× V1÷V2÷1000

                =0.062×(A+0.0141)÷W

2)按樣本蛋白濃度計算

FFA含量(μmo/mg prot)= (A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000

                =0.062×(A+0.0141)÷Cpr

 

V1加入樣本體積,0.6mL;V2:萃取液體積,1mLV3:加入血清(漿)體積,0.05 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:動物組織樣品質(zhì)量,g; 10001 μmol=1000 nmol

 

注意事項:

1.        蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機相待測液直接測定,可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測定試劑盒。

2.        Z低檢出限為20 nmol/mL。

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