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脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase,LPL)試劑盒說明書

發布時間:2023/5/17點擊次數:489

脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipaseLPL)試劑盒說明書

微量法100T/48S

 

        :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

脂蛋白酯酶是脂肪細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、乳腺細胞及巨噬細胞等實質細胞合成的一種酶,可催化甘油三脂水解為脂肪酸和單酸甘油酯,以供組織氧化供能和貯存,并在不同的組織表現出不同的生理意義。

 

測定原理:

脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產生4-硝基苯酚,在400nm有特征吸收峰。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、冷凍離心機、研缽、水浴鍋、可見分光光度計/酶標儀微量石英比色皿/96孔板

 

試劑組成和配制

試劑一:液體105mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體4mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體10mL×1瓶,4℃保存。

 

樣品處理:

1.        組織:按照質量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清待測。

2.        細胞:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清待測。

3.        血清:直接測定。

 

測定操作:

 


對照管

測定管

樣品(μL

20

20

試劑一(μL

80


試劑二(μL


80

混勻,45℃水浴10min

試劑三(μL

100

100

充分混勻,25℃靜置2min,于微量石英比色皿/96孔板,測定400nm處吸光值,記為A對照管和A測定管,△A=A測定管- A對照管

 

計算公式:

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y= 0.0581x -0.0169R2=0.9982

1.按照蛋白濃度計算

 

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫克蛋白每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mg prot= △A+0.0169÷ 0.0581×V反總÷V×Cpr÷T

= 17.21×△A+0.0169÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每克組織每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/g 鮮重)=(△A+0.0169÷0.0581×V反總÷W×V÷V樣總)÷T

= 17.21×(△A+0.0169÷W

3.按照細胞數量計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每104個細胞每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/104 cell= (△A+0.0169÷0.0581×V反總÷V×細胞數量÷V樣總)÷T

                                        = 17.21×(△A+0.0169÷細胞數量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫升血清每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mL=(△A+0.0169÷0.0581×V反總÷V÷T

                                 = 17.21×(△A+0.0169

V反總:反應總體積,0.2mLV樣:反應體系中加入樣本體積,0.02mLW:樣本質量,gV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,10min

 

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y= 0.029x -0.0169R2=0.9982

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫克蛋白每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mg prot= △A+0.0169÷ 0.029×V反總÷V×Cpr÷T

= 34.42×△A+0.0169÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每克組織每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/g 鮮重)=(△A+0.0169÷0.029×V反總÷W×V÷V樣總)÷T

= 34.42×(△A+0.0169÷W

3.按照細胞數量計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每104個細胞每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/104 cell= (△A+0.0169÷0.029×V反總÷V×細胞數量÷V樣總)÷T

                                        =34.42×(△A+0.0169÷細胞數量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫升血清每分鐘水解產生1μmol 4-硝基苯酚為一個酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mL=(△A+0.0169÷0.029×V反總÷V÷T

                                 = 34.42×(△A+0.0169

V反總:反應總體積,0.2mLV樣:反應體系中加入樣本體積,0.02mLW:樣本質量,gV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,10min

 

注意事項:

1.        試劑三加入混勻后靜置兩分鐘立即測定,否則影響吸光值。

2.        吸光值過高或者測定結果不穩定,則將酶液進行適當的稀釋,并在計算公式中乘以稀釋倍數。

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