過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(鉬酸銨比色法)說明書

過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(鉬酸銨比色法)說明書

微量法100管/96樣

測定意義：                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統中具有重要作用。

測定原理：

過氧化氫能氧化MoO₄^2-成MoO₅^2-,MoO₅^2-接受氫氧根的電子成鍵，分子間立即脫水縮合，得到穩定的黃色復合物(H₂MoO₄·XH₂O)_n在405nm處有強烈吸收峰，其吸光值和過氧化氫濃度成線性關系。測定出體系剩余過氧化氫在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。

需自備的儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃避光保存；

試劑二：液體25 mL×1瓶，常溫保存；

試劑三：液體60 mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、   酶標儀預熱30min以上，調節波長至405 nm。

2、在EP管中加入下列試劑

CAT活性計算：

1、標準曲線：y = 0.09x + 0.0013      R² = 1      x：體系中過氧化氫濃度變化值（μmol/mL）

                                          y：吸光值差值ΔA

2、血清（漿）CAT活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷V樣÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)

3、組織、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V樣÷V樣總）÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷W

V反總：反應體系總體積，0.8 mL；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL。

注意事項：

1、   預實驗若發現酶活性過高（A測定＜0.1），可用提取液適當稀釋樣品后測定，并在計算公式中乘以相應稀釋倍數。

2、   若A空白＜A測定，一方面可能是酶活性過低，可將反應時間2延長到5min,另一方面可能樣本中雜質干擾嚴重，可將樣本稀釋5倍左右后測定，并在計算公式中代入實際反應時間和乘以相應稀釋倍數。