過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(紫外吸收法)說明書

過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(紫外吸收法)說明書

微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統中具有重要作用。

測定原理：

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H₂O₂，使反應溶液240nm下的吸光度隨反應時間而下降，根據吸光度的變化率可計算出CAT活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

工作液：液體24mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至240nm，蒸餾水調零。

2、   測定前將CAT檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、   準備96孔UV板一塊（非普通酶標板，普通酶標板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于340nm務必使用UV板）。

4、   在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，記錄240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計算ΔA＝A1-A2。

注意事項：出現負值怎么辦？

首先檢查吸光值是否超過3，如果超過3很可能是沒有用UV板，請換用UV板。如果未超過3，仍然出現負值則檢查反應過程是否產生氣泡，氣泡多說明酶活性太高，氣泡影響產生了負值，可以將樣本用提取液稀釋10倍后再檢測。如果稀釋樣本或反應體系沒有產生氣泡仍然出現較小的負值，說明該樣本測不到該酶活。

CAT活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=459×ΔA

2、組織、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=459×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T =0.917×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：H₂O₂摩爾消光系數，4.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數，500萬。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=918×ΔA

2、組織、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=918×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=1.836×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：H₂O₂摩爾消光系數，4.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數，500萬。